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Boletim informativo

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FIOCRUZ 2009

FIOCRUZ  2009

OBS: DR. LUIS MOURA COMPROVOU EM HUMANOS POR 59 ANOS O QUE ESSE ESTUDO COMPROVOU EM ANIMAIS

ARTIGO COMPLETO EM PDF

Utilização do camundongo NOD (Non-obese diabetic) como modelo de

estudo sobre a eficácia da autohemoterapia.

Dr. Flávio Alves Lara

Bacharel em Microbiologia

Mestre em Biociências e Biotecnologia

Doutor em Química Biológica

Assistente de Pesquisa do Laboratório de Microbiologia Celular

Instituto Oswaldo Cruz

Fundação Oswaldo Cruz

Fica aqui registrado que se trata de um estudo preliminar, que não dá respaldo científico ao

uso da ferramenta em humanos. Apesar da sua provável eficácia em um modelo animal

clássico de doença autoimune, seu mecanismo de ação e riscos em potencial não são

conhecidos.

Endereço:

Flavio Alves Lara

Laboratório de Microbiologia Celular

Pavilhão Hanseníase, sala 27

Av. Brasil 4365 – Manguinhos

Rio de Janeiro – Brasil

CEP: 21045-900

e-mail: falara@ioc.fiocruz.br

Introdução

          A linhagem de camundongo NOD (Non-obese diabetic) é largamente utilizada

em estudos envolvendo modulação da resposta imune, fisiologia de linfócitos T

reguladores e diabetes. Os animais dessa linhagem apresentam o desenvolvimento

espontâneo de uma síndrome autoimune, levando em poucas semanas de vida à

infiltraçäo linfomononuclear progressiva das ilhotas de Langerhans (insulite), iniciada

na quinta semana de vida, levando ao desenvolvimento do quadro clínico de diabetes

dependente de insulina (Kikutani e Makino, 1992). A linhagem NOD foi gerada por

pesquisadores japoneses através da indução de polimorfismo no lócus Idd3, associado à

produção de IL-2, o que acarreta no desaparecimento da população de linfócitos T

reguladores (Makino e cols, 1980). A perda da população de lifocitos responsáveis pela

gestão da imunotolerancia acarreta em um leque maior de síndromes autoimunes a

serem observadas na supracitada linhagem, tais como sialites autoimune, tireoidites

autoimune, polineuropatia periférica autoimune e dermatite sistêmica autoimune.

Estudos recentes apontam o papel imunomodulador apresentado por

componentes sanguines tais como plaquetas e heme (Porto e cols. 2007; Graca-Souza e

cols. 2002; Knighton e cols. 1986).

Dessa forma, decidimos no presente estudo fracionar os componentes do

sangue em três: fração celular, fração plasmática e fração heme, realizando protocolo

semelhante à autohemoterapia em camundongos NOD, observando dessa forma a

contribuição individual de cada componente para a imunomodulação já observada

durante o tratamento envolvendo a autohemoterapia em humanos (comunicação

pessoal). Utilizamos como grupo controle animais injetados com salina tamponada,

utilizando-se um total de 20 animais para cada condição.

Metodologia

Frações do sangue

A partir de uma colônia isogênica (mesmo pool genético) de camundongos BalbC

NOD, machos foram sacrificados por asfixia em câmara de CO2 e sangrados com a

ajuda de uma seringa contendo heparina como anticoagulante. O sangue foi rapidamente

centrifugado a 1000g por 10 minutos, no sentido de separarmos a fração celular (que

nas pranchas das figuras 1 e 2 são abreviadas como sangue) e a fração plasmática (que

nas figuras 1 e 2 são chamadas de plasma). Ambas as frações são congeladas em freezer

para uso posterior.

Solução de Heme

Neste trabalho uma solução de 10mM de heme (Fe-Protoporfirina IX) foi preparada da

seguinte forma: heme em pó adquirido da empresa Molecular Products foi resuspendido

em solução de NaOH 0.1N, e posteriormente tamponado com PBS (tampão fosfato

tamponado a pH 7,2).

PBS

A solução de PBS foi montada através da combinação de soluções contendo 100mM de

fosfato de sódio monobásico e dibásico adicionados de 150mM de NaCl até atingir-se o

pH 7,2. Todos os sais foram adquiridos da empresa Merck.

Tratamento

O tratamento consistiu de injeções intramusculares de 10ml dos diferentes estímulos

(fração celular do sangue, fração plasmática do sangue, heme e PBS) em apenas um dos

membros inferiores por vez, a cada 2 semanas, de forma que um mesmo membro

recebia injeções a cada 4 semanas. Não foram observados nos animais em questão sinais

maiores de desconforto atribuídos ao tratamento. Foram utilizados 20 animais por

grupo, iniciando-se o tratamento no segundo mês de vida. Divergências no padrão de

dermatite autoimune foram registradas ao longo do período, interrompendo-se o estudo

ao sexto mês de vida.

Dessa forma, decidimos no presente estudo fracionar os componentes do sangue em

três: fração celular, fração plasmática e fração heme, realizando protocolo semelhante à

autohemoterapia em camundongos NOD, observando dessa forma a contribuição

individual de cada componente para a imunomodulação já observada durante o

tratamento envolvendo a autohemoterapia em humanos (comunicação pessoal).

Utilizamos como grupo controle animais injetados com salina tamponada, utilizando-se

um total de 20 animais para cada condição.

Resultados e discussão

Após 4 meses de tratamento, é vivível a diferença entre os animais tratados

com injeções contendo a fração celular e plasmática do sangue, quando comparados aos

animais tratados com heme e salina (figura 1 e 2). É possível observar regiões de

foliculite e dermatite autoimune, evidenciadas por setas. Na região ventral, onde tanto a

pele como os folículos pilosos são mais susceptíveis ao ataque autoimune, as diferenças

são mais evidentes, tornando clara uma maior eficácia em imunomodulação do

tratamento envolvendo a fração celular (sangue), quando comparado aos demais,

incluindo-se o tratamento envolvendo a injeção intramuscular da fração plasmática do

sangue (plasma).

Os animais que receberam injeções intramusculares contendo a fração celular

do sangue apresentaram aspecto normal, semelhante a camundongos selvagens não

NOD. Já animais tratados com todos os demais estímulos, apresentaram, mais

severamente os grupos controle e heme, arrepiamento de pelo quando estimulados,

demonstrando desconforto, letargia, perda de peso e tremores. Não foi observada

nenhuma diferença entre o grupo de animais estimulados com heme e o grupo controle,

estimulados com salina tamponada.

Os resultados colhidos até o momento apontam para um novo e inesperado

mecanismo envolvendo a autohemoterapia. Seria mais lógico supor que o mesmo

estivesse diretamente ligado à liberação de heme após a digestão proteolítica da

hemoglobina, ativando dessa forma mediadores imunes locais, seja integro ou após ser

degradado à bilirrubina, ferro e monóxido de oxigênio. É bem reconhecido seu papel

como ativador de migração e geração de radicais livres em neutróficos (Porto e cols.

2007; Graca-Souza e cols. 2002), assim como seu papel como ativador dos receptores

semelhantres a Toll 4 (TLR4) (Figueiredo e cols, 2007).

No entanto, a administração de 100nMoles de heme intramuscularmente não

apresentou qualquer efeito no quadro autoimune de animais NOD.

Nos voltamos então para a fração celular do sangue, a única que apresentou

forte efeito imunomodulador. Acreditamos que a pouca ação da fração plasmática se

deve aos contaminantes presentes da fração celular, que provavelmente te juntam a esta

após lise celular proveniente do procedimento de coleta de sangue. Sabemos que o

efeito benéfico da fração celular não é proveniente da ação de inoculação de células

sanguíneas viáveis no ambiente intramuscular, visto que esta fração foi congelada após

seu preparo e descongelada previamente ao uso, procedimento que inviabiliza a

existência de células viáveis. É conhecido também que o tratamento prévio do sangue

com ozônio, o que acarreta no rompimento de todas as células ali presentes, aumenta

sua eficácia como imunomodulador (comunicação pessoal). Dessa forma, acreditamos

em um componente protéico presente no interior de alguma população celular presente

no sangue como responsável pelos efeitos terapêuticos da autohemoterapia.

O heme é o grupamento prostético da hemoglobina, e não apresentou qualquer

efeito, no entanto, peptídeos gerados a partir da hidrolise da hemoglobina apresentam

uma gama de efeitos no organismo de mamíferos, dentre eles a cascata de sinalização de

proteína kinase C (PkC) e caseina kinase 2 (Chen-Roetling et al, 2008). Os eritrócitos

lisados e injetados intramuscularmente dessa forma estariam envolvidos na ação

terapêutica da autohemoterapia. Temos que ter em mente também que um antígeno

comum e não ativador como a hemoglobina pode ser subvertido a um imunoativador,

supressor ou modulador por estar sendo reconhecido fora de seu ambiente natural, o

sangue. O grupo de evidencias que descrevem as diferenças no reconhecimento de

antígenos decorrentes ao ambiente e/ou o tipo celular através dos quais são apresentados

às células efetôras criou a hipótese do “Danger Model” (Matzinger, 2002).

Por outro lado, não podemos nos abster em discutir um outro tipo celular

potencialemnte envolvido no efeito terapeutico visualizado na fração celular do sangue,

as plaquetas. Um grande numero de fatores de crescimento são porduzidos e

armazenados no interior dessas células, tais como: fator de crescimento derivado de

plaquetas (PDGF), um potente agente quimiotático, TGF-b (transforming growth factor-

β) que possui atividade imunosupressora por evitar a ativação de linfócitos e

macrofagos, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), IGF-1 (insulin-like growth

factor-1) também reconhecido imunomodulador por aumentar a viabilidade celular de

fagocitos, dentre outros fatores de crescimento. De fato, autohemoterapia utilizando-se

apenas da fração plaquetária já é utilizada em vários tipos de tratamento, de implantes

ósseos à cura de ulcerações cutâneas, associadas ou não à diabetes (O’Connell e cols.

2008; Sanchez e cols. 2007; Knighton e cols. 1990; Knighton e cols. 1986).

Como conclusão, observamos novas evidencias a respeito da eficácia da

autohemoterapia como ferramenta terapêutica imunomodulatória. Nossos resultados

iniciais apontam para a participação preponderante da fração celular em detrimento da

fração plasmática e do componente heme. Novos estudos tornam-se necessário para

uma total compreensão do mecanismo de ação da supracitada ferramenta terapêutica.

Referências

Chen-Roetling J, Li Z, Regan RF (2008). Hemoglobin Neurotoxicity is Attenuated by

Inhibitors of the Protein Kinase CK2 Independent of Heme Oxygenase Activity. Curr

Neurovasc Res. 5, 193-8.

Graca-Souza AV, Arruda MA, de Freitas MS, Barja-Fidalgo C, Oliveira PL (2002).

Neutrophil activation by heme: implications for inflammatory processes. Blood. 99,

4160-4165.

Kikutani H, Makino S (1992). "The murine autoimmune diabetes model: NOD and

related strains". Adv. Immunol. 51: 285–322.

Knighton DR, Ciresi KF, Fiegel VD, Austin LL, Butler ELL. Classification and

treatment of chronic nonhealing wounds: successful treatment with autologous plateletderived

wound healing factors (PDWHF). Ann surg 1986; 204:322-30.

Knighton DR, Ciresi K, Fiegel VD, Schumerth S, Butler E, Cerra F. Stimulation of

repair in chronic, non healing, cutaneous ulcers using platelet-derived wound healing

formula. Surg Gynecol Obstet 1990; 170:56-60.

Porto BN, Alves LS, Fernández PL, Dutra TP, Figueiredo RT, Graça-Souza AV, Bozza

MT. Heme induces neutrophil migration and reactive oxygen species generation

through signaling pathways characteristic of chemotactic receptors. J Biol Chem. 2007

Aug 17;282(33):24430-6.

MF, Oliveira PL, Graça-Souza AV, Bozza MT, Figueiredo RT, Fernandez PL, Mourao-

Sa DS, Porto BN, Dutra FF, Alves LS, Oliveira. Characterization of heme as activator

of Toll-like receptor 4. J Biol Chem. 2007 Jul 13;282(28):20221-9

Matzinger P (2002). The danger model: a renewed sense of self. Science. 296, 301-305.

Makino S, Kunimoto K, Muraoka Y, Mizushima Y, Katagiri K, Tochino Y (1980).

"Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice". Jikken Dobutsu 29 (1): 1–13.

O’Connell S, Impeduglia T, Hessler K, Wang XJ, Carroll R, Dardik H. Autologous

platelet-rich fibrin matrix as cell therapy in the healing of chronic lower-extremity

ulcers. Wound Rep Reg 2008; 16:749-756.

Sánchez M, Anitua E, Azofra J, Andía I, Padilla S, Mujika I. Comparison of surgically

repaired Achilles tendon tears using platelet-rich fibrin matrices. The American Journal

of Sports Medicine 2007; 35 (2): 245-51.

Plasma

Heme

Figura 1- Visão dorsal de fêmeas de camundongos NOD de 6 meses de

idade com 4 meses de tratamento envolvendo injeções intramusculares

contendo diferentes estímulos.

Animais enquadrados no grupo de tratamento envolvendo administração de

plasma e sangue apresentam aparência dorsal saudável, no entanto animais do

grupo tratado com plasma apresentam leve arrepiamento de pelo, indicativo de

desconforto. O mesmo não é visto no grupo tratado com a fração celular do

sangue. Animais tratados com PBS (salina tamponada) e heme (Fe-

Protoporfirina IX) apresentam claro sinal de dermatite, com perda de pelo (setas)

e visível arrepiamento de pelo.

Sangue

Figura 2- Visão ventral de fêmeas de camundongos NOD de 6 meses de

idade com 4 meses de tratamento envolvendo injeções intramusculares

contendo diferentes estímulos.

A visão ventral torna evidente a diferença de eficácia entre o tratamento usando

a fração celular do sangue, e o tratamento envolvendo a fração plasmática.

Enquanto os primeiros apresentam ausencia total de dermatite, animais tratados

com a fração plasmática do sangue apresentam níveis de inflamação

Esse artigo tem propósitos apenas informativos. NÃO FORNECE ORIENTAÇÕES MÉDICAS. quanto o autor e divulgador não se responsabilizam por quaisquer conseqüências possíveis oriundas de qualquer tratamento, procedimento, exercíc

 

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